Sveučilište u Zagrebu Medicinski fakultet

Polaznici će steći znanje o važnosti multiplo-rezistentnih bakterija u bolnicama i izvanbolničkoj sredini. Naučit će prepoznavati fenotip rezistencije karakterističan za pojedine vrste bakterija i mehanizme rezistencije i značenje pojedinih vrsta multirezistentnih bakterija kao što su ESBL, ampC i karbapenemaza producirajuće enterobakterije, meticilin-rezistentni stafilokoki, vankomicin rezistentnih enterokoka i penicilin neosjetljivih pneumokoka u bolničkoj i izvanbolničkoj sredini.

Polaznici će steći znanje o mehanizmima bakterijske rezistencije na antibiotike i značenje tih mehanizama za pravilan odabir terapija u bolesnika inficiranih multirezistentnim bakterijama. Moći će prepoznavati pojedine mehanizme rezistencije na temelju rutinskog testiranja osjetljivosti i odrediti koje testove je potrebno dalje provoditi da bi se identificirali geni rezistencije i spriječilo njihovo širenje, te kako interpretirati rezultate fenotipskih i molekularnih testova.

1. Enterobakterije producenti β-laktamaza proširenog spektra (ESBL): Β-laktamaze proširenog spekta razgrađuju oksimino cefalosporine i aztreonam. Proširene su među hospitalnim izolatima Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli a u novije vrijeme se sve češće javljaju i u izvabolničkih pacijenata. Dijele se u tri velike porodice: TEM, SHV i CTX-M. TEM i SHV β-laktamaze proširenog spektra se najčešče javlaju u hospitalnim izoaltima dok su CTX-M β-laktamaze češće u izvanbolničkoj populaciji. TEM i SHV β-laktamaze nastaju od parentalnih TEM-1, TEM-21 i SHV-1 β-laktamaza mutacijama koje mijenjaju konfiguraciju aktivnog središta i šire spektar djelovanja enzima. Za razliku od njih CTX-M β-laktamaze su nativne ESBL a nastale su od kromosomskih β-laktamaza vrste Kluyvera ascorbata i Kluyvera georgiana. Postoje i rijeđe vrste β-laktamaza proširenog spektra kao što su PER, VEB i IBC β-laktamaze.  ESBL se šire  konjugativnim prijenosom plazmida između bakterija iste ili različitih vrsta. Bakterije producenti ESBL su česti uzročnici epidemija hospitalnih infekcija koje se teško kontroliraju i liječe jer su multiplo rezistentne na većinu antibiotika osim karbapenema.   Nefermentativne bakterije kao što su pseudomonas ili acinetobakter također mogu posjedovati ESBL ali rijeđe nego enterobakterije i to obično rijeđe varijante kao što su PER, VEB i IBC.  Laboratorijska detekcija ESBL se vrši pomoću dvostrukog disk sinergističkog testa a karaterizacija se vrši pomoću izoelektričnog fokusiranja, PCR-a i sekvenciranja blaESBL gena. Kod vrsta koje imaju kromosomsku ampC beta-laktamazu je otežana fenotipska detekcija ESBL jer ampC beta-laktamaze mogu antagonizirati sinergistički učinak klavulanske kiseline pa se preporučuje raditi testiranje u podlozi koja sadržava kloksacilin-inhibitor ampC beta-laktamaza.

Plazmidne AmpC beta-laktamaze: Plazmidne AmpC beta-laktamaze su nastale od prijenosom kromosomskih ampC gena bakterija iz rodova Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas i Acinetobacter na kromosom. Javljaju se u vrstama koje nemaju kromosomski ampC gen kao što je Klebsiella spp, Salmonella i Proteus spp ili kod vrsta koje imaju slabo izraženu ekspresiju kromosomskog ampC gena kao što je slučaju u E. coli. Uzrokuju rezistenciju na cefalosporine treće generacije, cefamicine i na kombinacije beta-laktama i inhibitora beta-laktamaza ali ne djeluju na cefalosporine četvrte generacije.Pripadaju CMY, FOX, MOX, BIL, DHA, ATC, i ostalim porodicama. Detekcija ampC beta-laktamaza se vrši modificiranom Hodge testom diskom cefoksitina ili metodom kombiniranih diskova s fenilboroničnom kiselinom koja inhibira ampC beta-laktamaze. Rezistencija na karbapeneme u enterobakterija

Enterobakterije mogu razviti rezistenciju na karbapeneme uslijed hiperprodukcije beta-laktamaza proširenog spektra ili plazmidnih ampC beta-laktamaza  u kombinaciji s gubitkom porina vanjske membrane, zbog produkcije karbapenemaza iz grupe A , zbog produkcije metalo-beta-laktamaza iz koje spadaju u klasu B  ili OXA-48 beta-laktamaze iz klase D.  Karbapenem-rezistentne enterobakterije su dosada opisane u SAD, Izraelu, Grčkoj, Švicarskoj, Njemačkoj, Italiji i Ujedinjenom Kraljevstvu. U nas je do sada opisana rezistencija na karbapeneme u K. pneumoniae zbog produkcije VIM-1 ili NDM-1 metalo beta-laktamaze i KPC-2 beta-laktamaze. Detektiraju se u laboratoriju modificiranim Hodge testom i metodom kombiniranih diskova s inhibitorima kao što je EDTA za detekciju metalo-beta-laktamaza ili fenilboronične kiseline za detekciju KPC varijatni.

2. Nefermentativne bakterije producenti karbapenemaza. Karbapenemaze su enzimi koji razgrađuju karbapeneme (imipenem, meropenem, ertapenem) Najčešće se pojavljuju u izolatima Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii. Dijele se u tri grupe: A, B i C. Grupu A obično nalazimo u enterobakterija. Te karbapenemaze su kodirane kromosomski i nisu prenosive s jedne bakterijske stanice na drugu. U toj skupini se nalalze NMC, SME, GES i IMI β-laktamaze. Uzrokuju rezistenciju niskog stupnja i na imipenem i na meropenem koja postaje klinički značajna jedino u kombinaciji s drugim mehanizmima rezistencije kao što su gubitak porina i efluks. U skupini B se nalaze metalo β-laktamaze iz VIM, IMP, SIM i NDM porodice koje uzrokuju visoki stupanj rezistencije na sve karbapeneme bez sudjelovanja drugih mehanizama rezistencije. One trebaju cink kao kofaktor pa se zato nazivaju metalo β-laktamaze. Inhibirane su kelatorima metalnih iona kao što su EDTA, merkaptosumporna i merkaptopropionska kiselina.  VIM porodica je proširena u Europi, posebno u Mediteranskim zemljama i na Dalekom istoku. Postoji preko 34 alelske varijante.  Metalo-beta-laktamaze najčešće proizvode izolati P. aeruginosa i A. baumannii ali se susreću, zasada dosta rijetko i u enterobakterija. Geni koji kodiraju te β-laktamaze su locirani na prenosivim genetskim elementima kao što su integroni i zbog toga mogu nastati hospitalne epidemije koje je teško suzbiti. Metalo β-laktamaze uzrokuju rezistenciju na sve karbapeneme i cefalosporine ali ne djeluju na aztreonam. Geni koji kodiraju rezistenciju na aminoglikozide se često  nalaze na istom integronu kao i geni za metalo β-laktamaze pa je kod takvih izolata obično prisutna multipla rezistencija na većinu antibiotika osim kolistina. U grupi D se nalaze oksacilinaze koje najčešće nalazimo u A. baumannii. U grupi OXA-51/69 se nalaze intrinzične oksacilinaze koje su nativni enzimi vrste A. baumannii. One uzrokuju nizak stupanj rezistencije na karbapeneme ako ne postoji pojačane ekspresija blaOXA-51 gena uslijed insercijske sekvence smještene uzvodno od gena. U grupi OXA-23, OXA-24, OXA-58 i OXA-143 se nalaze stečene oksacilinaze koje same po sebi uzrokuju visoki stupanj rezistencije na oba karbapenema. Obično su kodirane na plazmidima i prenosive su s jedne bakterijske stanice na drugu. OXA-23 grupa je proširena po čitavom svijetu. OXA-58 se najčešće opisuje u Turskoj, Francuskoj, Italiji i Njemačkoj dok je OXA-24/40 grupa prije bila ograničena na sjevernu Ameriku i Iberijski poluotok ali danas postoje izvještaji iz Brazil,a Bugarske, Kine i Tajvana a također je opisana i u Hrvatskoj. Izolati A. baumannii koji proizvode oksacilinaze pokazuju najčešće mutliplu rezistenciju na većinu antibiotika uključujući sve β-laktame, aminoglikozide i fluorokinolone.

Osim karbapenemaza iz grupe B i D gubitak porina vanjske membrane (CarO i pojačana aktivnost efluks pumpi također mogu pridonijeti rezistenciji na karbapeneme.

Multirezistentni izolati A. baumannii su svrstani u tri velika internacionalna klona (international clonal lineage, prije EU klonovi). Osim ta tri danas su opisani i novi klonovi koji cirkuliraju u različitim geografskim područjima. Sojevi sa stečenim oksacilinazama obično spadaju u EU klon 2.   Pseudomonas aeruginosa je bakterija koja predstavlja fenomen u bakterijskoj rezistenciji budući da posjeduje brojne urođene mehanizme, poput konstitutivne ekspresije ampC β-laktamaze, efluksnih membranskih crpki i slabe propusnosti vanjske membrane, ali istovremeno može steći nove mehanizme rezistencije, među kojima su i stečene karbapenemaze. Rezistencija na karbapeneme obično nastaje zbog produkcije karbapenemaza iz klase A (KPC) ili klase B (VIM, IMP, NDM, GIM, SPM, DIM), modifikacije OprD porina vanjske membrane ili pojačane aktivnosti efluks pumpi. U Hrvatskoj je dosada opisana VIM-2 varijanta koja je proširena po čitavnom svijetu. VIM varijante dominiraju u mediteranskim zemljama dok IMP varijante prevladavaju na Dalekom istoku. Geni koji kodiraju metalo-beta-laktamaze se obično nalaze u sklopu integrona koji sadržavaju i gene rezistencije na aminoglikozide. Rezistencija na cefalosporine proširenog spektra u nefermentativnih bakterija se razvija zbog hiperekspresije kromosomske ampC beta-laktamaze ili zbog akvizicije ESBL, najčešće iz PER, VEB ili IBC porodice a u rijeđim slučajevima su opisane i TEM-116, SHV-12 i CTX-M-2. U Acinetobacter spp rezistencija na ampicilin/sulbaktam nastaje zbog hiperprodukcije TEM-1 beta-laktamaze. Enzimi koji modificiraju aminoglikozide kao što su adenilaze, acetilaze ili fosforilaze su najčešći mehanizam rezistencije na aminoglikozide u nefermentativnih bakterija a mutacije giraza ili topoizomeraza IV podjedinice se dovode u vezu s nastankom rezistencije na fluorokinolone. Posebno je zabrinjavajuća nedavna pojava rezitencije na kolistin u Acinetobacter baumannii zbog modifikacije lipida A, sastojka lipopolisaharida vanjske membrane. 

Meticilin rezistetni stafilokoki

Meticilin-rezistentni sojevi Staphylococcus aureus (MRSA) su se pojavili u kliničkoj praksi vrlo brzo nakon uvođenja meticilina u liječenje stafilokoknih infekcija, ranih 60-ih godina prošlog stoljeća. Rezistencija nastaje zbog stjecanja mecA gena koji kodira penicilin vežući protein PBP2' i mecC gena koji je nova varijanta opisana nedavno u Francuskoj. Expresija PBP2 uzrokuje rezistenciju na sve β-laktamske antibiotike uključujući cefalosporine i karbapeneme.  S vremenom su MRSA postali veliki problem, i to ne zbog veće patogenosti, nego zbog slabije dostupnosti liječenju: vankomicin, zasada najčešći antibiotik izbora , slabije je djelotvoran nego izoksazolil penicilini i često se u liječenju mora dodati i drugi antibiotik (najčešće rifampicin) a također je i znatno toksičniji od β-laktamskih antibiotika. Postoje i alternativne terapijske opcije kao što je linezolid, daptomicin i ceftarolin. MRSA ima sve karakteristike stafilokoka: otporan je na vanjske uvjete, lako se širi od inficiranog/koloniziranog bolesnika na druge bolesnike rukama osoblja ili kontaminiranim predmetima, može kolonizirati i osoblje koje tako posaje prijenosnikom, i dovodi do svih onih infekcija kao i meticilin-osjetljiv Staphylococcus aureus (infekcija rane, sepsa, endokarditis, pneumonija i osteomijelitis). Prevalencija MRSA u Hrvatskoj je od 3 do 50% ali se u svijetu sve češće pojavljuje kao izvanbolnički patogen.

Enterokoki su normalna flora u probavnom i urogenitalnom sustavu čovjeka i životinja. Uzrokuju oportunističke infekcije urinarnog trakta, rana, intraabdominalne apscese i sepsu. Imaju urođenu rezistenciju na mnoge antibiotike kao što su cefalosporini i klindamicin. Da bi se postigao baktericidni učinak neophodan za liječenje teških infekcija kao što je sepsa i endokarditis potrebno je kombinirati inhibitore sinteze staničnog zida kao što su penicilini ili glikopeptidi s aminoglikozidima. Veliki terapijski problem predstavlja rezistencija na peniciline, aminoglikozide i u novije vrijeme vankomicin. Prvi VRE (vankomicin-rezistentni enterokok) soj je opisan u Europi 1988. godine i u SAD 1989. Danas prevalencija VRE iznosi oko 2% u Europi i oko 10% u SAD.  Infekcije uzrokovane VRE sojevima se teško liječe. Geni koji kodiraju rezistenciju na vankomicin se mogu prenositi i na ostale Gram-pozitivne bakterije kao što su stafilokoki što rezultira u pojavi vankomicin-intermedijarnog ili vankomicin-rezistentnog stafilokoka (VISA ili VRSA) ili na ostale Gram-pozitivne bakterije kao što su streptokoki i listerije.

Na vježbama će polaznici savladati tehnike testiranja osjetljivosti bakterija na antibiotike, fenotipske testove za detekciju beta-laktamaza i karbapenemaza kao i molekularne metode za detekciju gena rezistencije na različite antibiotike. Također će raditi genotipizaciju bakterija PFGE metodom i MLST metodom. Plazmide koji kodiraju gene rezistencije će ekstrahirati komercijalnim kitom prema uputama proizvođača a određivanje inkompatibilne grupe plazmida će se vršiti PBRT metodom prema Carattoli i sur.

JOURNAL CLUB. Polaznici će raspravljati o važnim temama kao što su detekcija i karakterizacija meticilin - rezistentnih stafilokoka, vankomicin - rezistentnih enterokoka, ESBL - pozitivnih enterobakterija i karbapenemaza - producirajućih Gram-negativnih bakterija.

• Bradford PA. Extended-spectrum -lactamases in the 21st Century: Characterization, Epidemiology, and Detection of This Important Resistance Threat. Clin Microbiol Rev 2001;14(4):933-951.
• Bradford PA: What's new in β-lactamases? Curr Infect Dis Resp 2001; 3(1):13-19.
• Nordmann P, Poirel L. Emerginig carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin Microbiol Infect 2002;8:321-331.
• Marshall WF, Blair JE. The cephalosporins, Maxo Clin Proc 1999;74:187.
• Reese RE, Betts RF. Cephalosporins. U: Reese RE, Betts RF, Gumustop B, eds. Handbook of antibiotics, 3rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins, 2000;365-400.
• Asbel LE, Levison ME. Cephalosporins, carbapenems and monobactams. Infect Dis Clin North Am 2000;14:1435.
• Medical Letter. The choice of antibacterial drugs. Med Lett Drugs Ther 200143:69.
• Rossolini, G.M., M. M. D’Andrea, and C. Mugnaioli. 2008. The spread of CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases. Clin. Microbiol. Infect. 14(Suppl. 1):33-41.
• Jacoby, G. A., 2009. AmpC β-lactamases. Clin. Microbiol. Rev. 22:161-182.
• Nordmann, P., L. Poirel, and L. Dortet. 2012. Rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg. Infect. Dis. 18:1503-1507.
• Nordmann, P., M. Gniadkowski, C.G. Giske, L. Poirel, N. Woodford, V. Miriagou, and the European Network on Carbapenemases. 2012. Identification and screening of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Clin. Microbiol. Infect. 18:432-438.
• Nordmann, P., T. Naas, and L. Poirel. 2011. Global Spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg. Infect. Dis. 17:1791-1798.
• Cattoir, V. , and P. Nordmann. 2009. Plasmid-mediated quinolone resistance in gram-negative bacterial species: an update. Curr. Med. Chem. 16:1028-1046.
• Lauren, F., H. Chardon, M. Haenni, M. Bes, M.-E. Reverdy, J.-Y. Madec, E. Lagier, F. Vandenesch, and A. Tristan. 2012. MRSA harboring mecA variant gene mecC, France. Emerg. Infect. Dis. 18:1465-1467.
• Appelbaum, P.C. 2006. The emergence of vancomycin-intermediate and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. Clin. Microbiol. Infect. 12 (Suppl. 1):16-23.
• Howden, B.P., J.K. Davies, P.D.R. Johnson, T.P. Stinear, and M.L. Grayson. 2010. Reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus, including vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate strains: resistance mechanisms, laboratory detection, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 23:99-139.
• Kalenić S, Plečko V, Jelić I, Vegar V, Dadić D, Boduen Z. Vankomicin-rezistentni enterokoki. Liječnički Vjesnik 1997;119(10):298.
• Sušić E, Gverić-Krečak V. U povodu izolacije vankomicin-rezistentnog enterokoka u Šibeniku. Liječnički Vjesnik 2004;126(5-6):166-167.
• Leclercq R, Courvalin P. Resistance to glycopeptides in enterococci. Clin Infect Dis 1997;24:545-546.
• McDonald LC, Kuehnert MJ, Tenover FC, Jarvis WR. Vankomycin-resistant enterococci outside the health care setting, prevalence, sources and public health implications. Emer Infect Dis 1997;3:311.8.
• Chambers CF. Meticillin resistance in staphylocci: Molecular and Biochemical Basis and Clinical Implications. Clinical Microbiology Reviews 1997;10:781-6.Budimir A, Plečko V, Presečki-Stanko A, Tripković V, Rebrović B, Kalenić S. Brza identifikacija meticilin-rezistentnih sojeva Staphylococcus aureus (MRSA). Liječnički Vjesnik 2003;125(5-6): 159-160.
• Bedenić B, Plečko V, Sardelić S, Uzunović S, Godič Torkar K.: Carbapenemases in gram-negative bacteria: laboratory detection and clinical significance.Biomed Res Int. 2014;2014:841951. doi: 10.1155/2014/841951. Epub 2014 Jun 15.
• Bedenić B, Sardelić S, Vranić-Ladavac M, Barisić N, Ladavac R. Karbapenemaze Gram-negativnih bakterija.  Lijec Vjesn. 2014;136(3-4):94-103.
• Claeys KC, Fiorvento AD, Rybak MJ. A review of novel combinations of colistin and lipopeptide or glycopeptide antibiotics for the treatment of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Infect Dis Ther 2014; PMID 2475412, E pub
• Petrosillo N, Gianella M, Antonelli M, Antonini M, Barsic B, Belancic L et al. Clinical experience of colistin-glycopeptide combination in critically ill patients infected with Gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58(2):851-58.
• Grover, C.N., Sahni, B.A.K,, Bhattacharya, C.S. 2013. Therapeutic challenges of ESBLs and AmpC β-lactamase producers in a tertiary care center. Medical Journal Armed Forces; 69:4-10.
• Philippon A, Arlet G, Lagrange H: Origin and impact of plasmid-mediated extended-spectrum β-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13(Suppl 1):17-29.
• Tan TJ, Yong NG LS, Koh TK, Hsu LY. Evaluation of screening methods to detect plasmid-mediated AmpC in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother 2009;53(1):146-149.
• Canton R, Akova M, Carmely Y, Giske CG, Glupczynski Y, Gniadkowski M, Livermore DM, Miriagou V, Naas T, Rossolini GM, Seifert H, Woodford N, Nordmann P. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect 2012;18:413-431.
• Sengstock DM, Thyagrajan R, Apalara J, Mira A, Chopra T, kaye KS. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: an emerging pathogen among older adults in community hospitals and nursing homes. Clin Infect Dis 2010;50(12):1611-1616.
• Medina T, Carmeli Y. The pivotal role of long-term care facilities in the epidemiology of Acinetobacter baumannii: another brick in the wall. Clin Infect Dis 2010;50(12):1617-1618.
• Strateva T, Yordanov D. Pseudomonas aeruginosa - a phenomenon of bacterial resistance. J Med Microbiol 2009;58:1133-48.
• Poole K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Front Microbiol 2011;2:1-13.
• Nodmann P, Poirel L. Strategies for identification of carbapenemase producing Enterobacteriacea. J Antimicrob Chemother 2013;68:487-9.
• Levy-Hara G, Gould I, Endimiani A i sur. Detection, treatment and prevention of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: recommendations from an International Working Group. J Chemother 2013;25:129-40.

Predavanja, vježbe, journal club

Pismeni ispit